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Lechu 07-08-2020 01:05 PM

Demultiplexing failures in MiSeq run
 
Hi All!

I am sequencing (on a MySeq platform) a custom library containing 4 i7 indexes. In principle, it works, but when I look on demultiplexing stats, there is quite a large proportion of unrecognized indexes (resulting in about 20% of all reads unassigned). My adapter primers that I used to amplify the library were PAGE-purified. I pasted the detailed stats below. What do you think might be the reason?

Cheers,
Lech


Code:

SampleNumber        0        1        2        3        4       
SampleName        None        1        2        3        4       
s_1_1101        12.85159        14.97901        24.74675        29.02787        18.39477       
s_1_1102        12.86999        15.04931        24.61071        29.25371        18.21628       

### Most Popular Index Sequences
### Columns: Sequence ReverseComplement HitCount
Index
ACATTA        TAATGT        209049
TGCACG        CGTGCA        178081
GATCAC        GTGATC        118236
CAGCGT        ACGCTG        108928
GCTTAC        GTAAGC        4512
GATAAC        GTTATC        4442
ACATAA        TTATGT        4079
GCTCAC        GTGAGC        3643
GATTAC        GTAATC        2996
GTTCAC        GTGAAC        2485
GTTTAC        GTAAAC        2366
GGTAAC        GTTACC        2306
ACATTC        GAATGT        1843
GTTAAC        GTTAAC        1577
TGCAAG        CTTGCA        1403
GCTTTC        GAAAGC        1395
GTTGAC        GTCAAC        1336
TGCACC        GGTGCA        1303
GTTTAT        ATAAAC        1246
GTTCAT        ATGAAC        1241
GGTTAC        GTAACC        1215
CATCGT        ACGATG        1166
GCTAAC        GTTAGC        1104
GGTCAC        GTGACC        1066
ACTTTC        GAAAGT        977
GGTGAC        GTCACC        933
CATCAT        ATGATG        922
CCTTTC        GAAAGG        877
ACTTTA        TAAAGT        848
TGCACA        TGTGCA        815
CAGCAT        ATGCTG        812
GATGAC        GTCATC        794
ACTTAA        TTAAGT        768
TTCCCT        AGGGAA        726
GCTTAA        TTAAGC        707
GTTTAA        TTAAAC        684
ACTTAC        GTAAGT        675
CCCTTC        GAAGGG        675
TGTAAC        GTTACA        671
GATCAT        ATGATC        657
CCTCAC        GTGAGG        642
TGCACT        AGTGCA        639
GTTGAT        ATCAAC        639
CCTTAC        GTAAGG        633
ACATAC        GTATGT        624
TGTACG        CGTACA        620
TTTCAC        GTGAAA        618
TGTAAG        CTTACA        618
TGCAAC        GTTGCA        595
GCTGAC        GTCAGC        592
CCTCAT        ATGAGG        583
TTTTTC        GAAAAA        582
GATAAA        TTTATC        559
GATTAA        TTAATC        558
TCTTTC        GAAAGA        537
GTTAAT        ATTAAC        535
GATTAT        ATAATC        533
GGTAAT        ATTACC        524
TCACGA        TCGTGA        519
GGTTAT        ATAACC        516
CATCAC        GTGATG        512
CCTCTT        AAGAGG        507
GGTAAG        CTTACC        478
GATAAT        ATTATC        467
GATCAA        TTGATC        459
GGTAAA        TTTACC        454
GCTCAT        ATGAGC        427
GCTTAT        ATAAGC        412
TGTACC        GGTACA        411
GGTTAA        TTAACC        405
TTTTAC        GTAAAA        402
TTTCCT        AGGAAA        396
GTTTTC        GAAAAC        394
GTTCCC        GGGAAC        392
GCATTC        GAATGC        375
CAGCTA        TAGCTG        374
GCCTTC        GAAGGC        371
ACCTTC        GAAGGT        369
TTCACT        AGTGAA        354
GTTTTT        AAAAAC        341
GCTTTA        TAAAGC        335
GCATAC        GTATGC        328
GTTCCT        AGGAAC        324
TTTCAT        ATGAAA        320
GGTGAT        ATCACC        320
GCCTAC        GTAGGC        318
TTTAAC        GTTAAA        316
CCTCTC        GAGAGG        315
TATCAC        GTGATA        301
CCATTC        GAATGG        300
GCATTA        TAATGC        297
GGCAAC        GTTGCC        297
GTTAAA        TTTAAC        297
AGCGTA        TACGCT        296
GATGAT        ATCATC        291
GCTCCC        GGGAGC        285
TTTCCC        GGGAAA        284
GGTACC        GGTACC        281
CCCTAC        GTAGGG        271
AATTAA        TTAATT        269


GenoMax 07-09-2020 02:38 AM

You have a set of indexes there that have a good number of reads. If they don't match indexes you expect then it is a different matter. There is not much you can do about the 20% reads you are losing.


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